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轉(zhuǎn)自羅氏診斷生命科學(xué)公眾號(hào)
隨著NGS檢測(cè)的臨床有效性不斷地被驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的樣本量逐漸地增多，實(shí)現(xiàn)NGS復(fù)雜流程在工作站上自動(dòng)化是大勢(shì)所趨。但是，在開放式的工作站上，客戶如何實(shí)現(xiàn)樣本打斷自動(dòng)化，一直沒(méi)有很好的解決方案。
通常，NGS建庫(kù)使用的打斷方法不外乎下面兩種，各有優(yōu)勢(shì)又各有缺點(diǎn)。
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一種是基于超聲波的物理打斷方法或稱為機(jī)械打斷。這種方法需要專門的設(shè)備和耗材，以Covaris的設(shè)備為代表。物理打斷有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，比如說(shuō)樣本斷點(diǎn)的隨機(jī)性高，不會(huì)有位點(diǎn)的偏好，也不會(huì)受樣本純度的影響。然而物理打斷的設(shè)備和耗材成本很高，并且難以在工作站中整合超聲設(shè)備實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。通常情況下物理打斷法處理一個(gè)樣本需要平均3-5分鐘的時(shí)間，因此一旦樣本數(shù)量變多，它就變成一個(gè)操作單一同時(shí)又極度耗時(shí)的方法。
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另一種是基于酶切打斷的方法，包括轉(zhuǎn)座子或各種混合水解酶等對(duì)DNA進(jìn)行化學(xué)切斷。酶切的方法不需要特殊的設(shè)備，只需要普通的PCR儀，可以批量的處理樣本并輕松在工作站上實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。同時(shí)酶切較物理打斷的DNA損耗更小，文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率更高，對(duì)于一些珍貴的樣本，文庫(kù)構(gòu)建的成功率更高。但是，目前的酶切試劑盒存在或多或少的數(shù)據(jù)偏好性。除此之外，酶切建庫(kù)試劑盒構(gòu)建的文庫(kù)會(huì)有一定比例的假陽(yáng)性嵌合，特別是做一些基因融合檢測(cè)的應(yīng)用時(shí)會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果的判讀。
雖然這些假陽(yáng)性干擾可以通過(guò)數(shù)據(jù)分析進(jìn)行過(guò)濾，但這對(duì)生信人員提出了更高的要求且?guī)?lái)了更多的工作量。同時(shí)，酶切對(duì)于樣本會(huì)有比較高的要求，比如樣本的純度(特別是EDTA的含量）和樣本的降解程度，都會(huì)對(duì)酶切的效果產(chǎn)生諸多的影響。這使得實(shí)驗(yàn)室對(duì)于不同來(lái)源或不同類型的樣本需要設(shè)置不同的SOP。對(duì)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員和管理人員都造成了一定的困擾。
如何整合物理打斷和酶切打斷的優(yōu)勢(shì)，解決這些實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的障礙？
答案是：
羅氏診斷KAPA EvoPlus Kit上市了！?
KAPA EvoPlus 主要解決了以下4個(gè)問(wèn)題：
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EDTA敏感性導(dǎo)致的酶切產(chǎn)物大小不穩(wěn)定性
圖1 100ng gDNA,37℃ 25 min 打斷，
KAPA UDI接頭，8循環(huán)擴(kuò)增
（圖片來(lái)源：羅氏診斷整理）
對(duì)含有不同EDTA濃度緩沖液的DNA進(jìn)行相同條件的打斷和建庫(kù)，可以看到文庫(kù)的大小都符合預(yù)期。
2.數(shù)據(jù)假陽(yáng)性
圖2 與物理打斷的建庫(kù)試劑盒（KAPA HyperPrep）進(jìn)行比較，
可以看到EvoPlus已經(jīng)將假陽(yáng)性的比例降至同一水平。
（圖片來(lái)源：羅氏診斷整理）
圖3 經(jīng)內(nèi)部測(cè)試，與國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上同類型酶切建庫(kù)試劑盒
進(jìn)行平行比較，Evoplus的假陽(yáng)性比例最低。
（圖片來(lái)源：羅氏診斷整理）
3.工作站移液步驟過(guò)多，試劑包裝對(duì)自動(dòng)化不兼容
KAPA EvoPlus簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程，減少了移液步驟以降低交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)混液及96孔板式包裝更匹配自動(dòng)化工作站，另有管式包裝可供手動(dòng)建庫(kù)用戶選擇。
圖4 打斷、末端修復(fù)和加A尾整合成一步反應(yīng)，預(yù)混液包裝
無(wú)需進(jìn)行反應(yīng)體系配制，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作流程。
（圖片來(lái)源：羅氏診斷整理）
4.實(shí)驗(yàn)流程長(zhǎng)，試劑穩(wěn)定性差，在工作站上難以長(zhǎng)時(shí)間存放而無(wú)法實(shí)現(xiàn)全流程無(wú)人值守
KAPA EvoPlus即便是ReadyMix預(yù)混液包裝，依然能長(zhǎng)期穩(wěn)定保存，試劑盒效期18個(gè)月。
圖5 經(jīng)內(nèi)部測(cè)試，打斷試劑在室溫5周之后
依然可以保持相當(dāng)?shù)拇驍嘈Ч?/strong>
（圖片來(lái)源：羅氏診斷整理）
*僅用于科學(xué)研究，不用于臨床診斷。MC-CN-01945有效期至2025年1月26日
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