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轉自：羅氏診斷生命科學公眾號
大家好，本堂課小羅將帶領大家繼續(xù)學習數(shù)字PCR，了解微反應體系氣泡控制對數(shù)字PCR的影響。
dPCR技術概述
數(shù)字聚合酶鏈式反應 (dPCR)，被視為第三代PCR 技術，是一種高精度的核酸檢測方法，無需校準即可實現(xiàn)目標模板的絕對定量。在 dPCR 中，含有目標核酸的樣品被分為數(shù)以萬計的分區(qū)，每個分區(qū)包含一個、幾個或沒有目標模板。擴增后，根據(jù)熒光強度將分區(qū)分為“陽性”或“陰性”，最后根據(jù)泊松算法計算模板的原始濃度。
與傳統(tǒng)的實時定量PCR（qPCR）相比，dPCR具有許多優(yōu)點，包括高精度和靈敏度、無需校準曲線即可對目標核酸進行絕對定量，以及檢測低濃度目標核酸的能力。dPCR憑借其出色的性能，已廣泛應用于核酸檢測，包括低豐度病原基因檢測、基因拷貝數(shù)變異 (CNV) 分析、單細胞基因表達分析、遺傳等位基因失衡檢測和無創(chuàng)產(chǎn)前檢測 (NIPT)等領域[1]。
現(xiàn)象—加熱導致氣泡產(chǎn)生及影響
dPCR 技術實現(xiàn)上述優(yōu)異性能表現(xiàn)的關鍵步驟是生成大量統(tǒng)一且獨立的分區(qū)，通常通過兩種策略來實現(xiàn)：
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一種是基于微孔，將樣品分配到數(shù)千到數(shù)萬個微孔腔室中；
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另一種是基于液滴的，將樣品分成皮升到納升的液滴，分散在不混溶的油中。
無論哪種分區(qū)方式，完成分區(qū)后，都要利用溫度控制模塊對所有微反應單元進行溫度循環(huán)以完成擴增反應，從而將目標片段進行信號放大。然而，在溫度循環(huán)中最顯著的問題是溶解在PCR反應體系或油相中氣體的逸散，根據(jù)氣體的溶解性質(zhì)，氣體在液體中的溶解度會隨著溫度升高會大幅度降低[2]，而這一特性對數(shù)字PCR來說，尤為重要。
圖1.（圖片來源：羅氏診斷整理）
PCR反應過程中伴隨著劇烈的溫度升降，由于溫度升高時氣體溶解度降低，會因脫氣（degassing）而形成微小氣泡。脫氣是芯片上聚合酶鏈式反應 (PCR) 失敗的一個眾所周知的原因，氣泡的形成會對數(shù)字PCR反應會產(chǎn)生諸多方面的影響，如導致加熱不均勻，擠壓 PCR混合物從反應室排出，出現(xiàn)的氣泡可能會取代反應室中的乳液，以及對液滴施加剪切力，從而導致液滴合并等問題，這些事件的發(fā)生均會對微孔陰陽性判斷造成干擾，進而對定量的準確性產(chǎn)生影響[3]。
圖2.（圖片來源：羅氏診斷整理）
如何防止氣泡形成？
此前已經(jīng)有很多研究者描述了許多不同的方法來避免氣泡產(chǎn)生的問題?？梢苑譃楸粍雍椭鲃臃椒▋纱箢悾褂玫闹饕夹g包括氣泡陷阱（bubble traps）、氣泡消除以及預防氣泡形成等方法，見表1。
Bubble traps通過將氣泡限制在特定區(qū)域以減少其干擾，已經(jīng)被應用到多種微流控體系中，但該方法受溫度的影響極為明顯，高溫會導致氣泡劇烈膨脹，進而導致擴散，因此在溫度變化劇烈的數(shù)字PCR反應中，該策略有明顯的局限性。
表1.（來源：羅氏診斷整理）
氣體在液體的溶解度除了受到溫度的顯著影響以外，氣壓變化也會明顯改變氣體溶解度。一般來說，隨著氣壓的增加，氣體在液體中的溶解度會隨之升高[2]。因而，對數(shù)字PCR體系進行系統(tǒng)加壓以增加氣體在液體中的溶解度，是預防氣泡形成的有效手段。
已有研究表明，具有主動外部壓力產(chǎn)生的加壓系統(tǒng)可以完全避免dPCR反應過程中氣泡產(chǎn)生的現(xiàn)象，能夠有效降低數(shù)字PCR在擴增循環(huán)中由于溫度急劇變化帶來的氣泡形成和擴散，進而避免了由此導致的微反應單元獨立性受損的情況，為精準定量提供保障[5]。
圖3.（圖片來源：羅氏診斷整理）
此外，芯片法數(shù)字PCR技術在微孔生成的時候，由于反應體系表面張力與芯片表面處理等原因，仍然有一定幾率出現(xiàn)“空泡”現(xiàn)象，即某些微孔無法被反應體系填充，而是被氣體占位，PCR加熱過程會導致氣泡膨脹，會對周圍的反應孔產(chǎn)生擠壓并導致反應體系的逸散，原本封閉的獨立反應單元無法獨立進行片段擴增，將會對定量結果產(chǎn)生顯著的影響。因此，對反應體系進行系統(tǒng)加壓，也是有效限制高溫導致的氣泡膨脹行之有效的辦法。
值得一提的是，這類“空泡”微孔在信號采集時容易被誤認為陰性微孔，而實際上這類微孔不應該被納入陰陽性計算。因此，數(shù)字PCR的反應體系具備質(zhì)控成為一個非常重要的條件，該條件可通過在體系中添加特定的熒光染料予以實現(xiàn)。擴增完成后，應在進行微孔陰陽性判斷前通過質(zhì)控染料將假陰性孔排除，再分別對陰陽性微孔進行計數(shù)，最后才能通過泊松分布校正得到更為準確的定量結果。
參考文獻：
[1] dPCR: A Technology Review
[2] Chemistry: Principles, Patterns, and Applications
[3] Digital droplet PCR on disk
[4] Active liquid degassing in microfluidic systems
[5] An optimal design method for preventing air bubbles in high-temperature microfluidic devices
*僅用于科學研究，不用于臨床診斷。MC-CN-02076有效期至2025年3月25日。
