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不斷發(fā)展的iPSC培養(yǎng)技術(shù)
目前，iPSC正用于藥物篩選、人類胚胎學(xué)和癌癥研究。因此，迫切需要研究產(chǎn)生和培養(yǎng)多能干細(xì)胞的有效系統(tǒng)。
盡管近期的培養(yǎng)基優(yōu)化技術(shù)取得了一定的進(jìn)展，使得無異源培養(yǎng)方法有了更多的選擇，但是，高效、安全、簡便的iPSC培養(yǎng)技術(shù)仍處于不斷發(fā)展之中。
除了培養(yǎng)基優(yōu)化和重編程方法以外，開發(fā)穩(wěn)健培養(yǎng)物的另一個關(guān)鍵因素似乎是細(xì)胞產(chǎn)生和發(fā)育的環(huán)境。
諾貝爾獎得主揭示
培養(yǎng)物環(huán)境的重要性
山中伸彌（Shinya Yamanaka）因其在干細(xì)胞研究領(lǐng)域取得的成果，與約翰•格登（John Gurdon）一起獲得諾貝爾獎。
他很早就證明缺氧條件（也稱為低氧條件）會增強(qiáng)細(xì)胞重編程。然而值得注意的是，從那時起，大部分涉及iPSC研究的發(fā)表文章卻繼續(xù)使用環(huán)境氧氣濃度和5%的二氧化碳(CO2)作為常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)。
優(yōu)化氧氣濃度變量至關(guān)重要
為有效評估新的方法，優(yōu)化氧氣濃度變量十分重要。在本研究中，我們報告了人類包皮成纖維細(xì)胞的最佳重編程方案（見圖2），該方案包括含有小分子混合物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)單附加型（Episomal）載體并進(jìn)行電穿孔。進(jìn)行這一研究的目的是確定將低氧條件納入方案是否可以提高重編程的效率。
兩種O2濃度實(shí)驗(yàn)
為實(shí)現(xiàn)這一目的，我們選用兩種O2濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將O2濃度精確維持在4%，并將在這一條件下得到的重編程結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)空氣O2濃度條件下得到的結(jié)果進(jìn)行比較。
圖3：成纖維細(xì)胞在電穿孔后24小時內(nèi)開始表達(dá)由pERC-V1編碼的基因并通過RFP信號反映。電穿孔后第二天，在低氧條件和常規(guī)氧條件下，觀察成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物的RFP熒光，顯示明亮表明pERC-V1質(zhì)粒上攜帶干細(xì)胞標(biāo)記物。我們估計大約40%的細(xì)胞明亮表達(dá)RFP。
在第10到12天，觀察到正常紡錘形成纖維細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生變化，在低氧條件下，許多細(xì)胞開始變成立方體形狀，顯示出更緊湊的細(xì)胞質(zhì)。在常規(guī)氧條件下，在此時間段內(nèi)看到的細(xì)胞較少。
到第15-16天，低氧條件培養(yǎng)物的形態(tài)變化非常明顯，而在常規(guī)氧條件下，這些形態(tài)變化才開始變得明顯。
在低氧條件下，許多集落附著良好，生長穩(wěn)健，形成具有典型形態(tài)的iPSC集落。
而在常規(guī)氧條件下，許多集落具有混合細(xì)胞類型的形態(tài)。經(jīng)過3次選擇性傳代后，在常規(guī)氧條件下獲得了看似穩(wěn)定的iPSC。經(jīng)過4次至5次傳代后，將兩種氧條件下成功重編程的集落接種到24孔板上，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)間接免疫染色操作。
分散酶處理后重新接種的集落往往比機(jī)械分散選取的集落附著情況更好。用Y-27632處理后，集落的存活率更高，在4天內(nèi)形成集落。傳代后7天，觀察到許多集落。然而，在低氧條件培養(yǎng)物中觀察到的集落形態(tài)類似于更純的成熟iPSC集落。
在本研究中，我們通過可調(diào)節(jié)O2濃度的CO2培養(yǎng)箱提供低氧條件，與常規(guī)氧條件相比，電穿孔后12天內(nèi)，我們始終能夠觀察到低氧條件下培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞形態(tài)變化，并且在3周后集落明顯更好。
雖然其他實(shí)驗(yàn)室可能使用不同的重編程方法或起始細(xì)胞類型，但很明顯，本研究提供的數(shù)據(jù)證明了在重編程期間保持低氧環(huán)境的優(yōu)勢。
