電泳裝置主要包括兩個(gè)部分:電源和電泳槽。電源提供直流電,在電泳槽中產(chǎn)生電場(chǎng),驅(qū)動(dòng)帶電分子的遷移。
電泳槽可以分為水平式和垂直式兩類。垂直板式電泳是較為常見的一種,常用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中蛋白質(zhì)的分離。電泳槽中間是夾在一起的兩塊玻璃板,玻璃板兩邊由塑料條隔開,在玻璃平板中間制備電泳凝膠,凝膠的大小通常是12cm14cm,厚度為1mm~2mm,近年來新研制的電泳槽,膠面更小、更薄,以節(jié)省試劑和縮短電泳時(shí)間。制膠時(shí)在凝膠溶液中放一個(gè)塑料梳子,在膠聚合后移去,形成上樣品的凹槽。水平式電泳,凝膠鋪在水平的玻璃或塑料板上,用一薄層濕濾紙連接凝膠和電泳緩沖液,或?qū)⒛z直接浸入緩沖液中。由于pH值的改變會(huì)引起帶電分子電荷的改變,進(jìn)而影響其電泳遷移的速度,所以電泳過程應(yīng)在適當(dāng)?shù)木彌_液中進(jìn)行的,緩沖液可以保持待分離物的帶電性質(zhì)的穩(wěn)定。
為了更好的了解帶電分子在電泳過程中是如何被分離的,下面簡單介紹一下電泳的基本原理。在兩個(gè)平行電極上加一定的電壓(V),就會(huì)在電極中間產(chǎn)生電場(chǎng)強(qiáng)度(E),L是電極間距離。
在稀溶液中,電場(chǎng)對(duì)帶電分子的作用力(F),等于所帶凈電荷與電場(chǎng)強(qiáng)度的乘積。這個(gè)作用力使得帶電分子向其電荷相反的電極方向移動(dòng)。在移動(dòng)過程中,分子會(huì)受到介質(zhì)粘滯力的阻礙。粘滯力(F’)的大小與分子大小、形狀、電泳介質(zhì)孔徑大小以及緩沖液粘度等有關(guān),并與帶電分子的移動(dòng)速度成正比,對(duì)于球狀分子,F(xiàn)’的大小服從Stokes定律,即:F’=6πrηυ式中r是球狀分子的半徑,η是緩沖液粘度,υ是電泳速度(υ=d/t,單位時(shí)間粒子運(yùn)動(dòng)的距離,cm/s)。當(dāng)帶電分子勻速移動(dòng)時(shí):F=F’,q?E=6πrηυ由此可以看出,遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比,與分子的大小和緩沖液的粘度成反比。
用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí),實(shí)際使用的是相對(duì)遷移率mR。帶電分子由于各自的電荷和形狀大小不同,因而在電泳過程中具有不同的遷移速度,形成了依次排列的不同區(qū)帶而被分開。即使兩個(gè)分子具有相似的電荷,如果它們的分子大小不同,由于它們所受的阻力不同,因此遷移速度也不同,在電泳過程中就可以被分離。有些類型的電泳幾乎完全依賴于分子所帶的電荷不同進(jìn)行分離,如等電聚焦電泳;而有些類型的電泳則主要依靠分子大小的不同即電泳過程中產(chǎn)生的阻力不同而得到分離,如SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。分離后的樣品通過各種方法的染色,或者如果樣品有放射性標(biāo)記,則可以通過放射性自顯影等方法進(jìn)行檢測(cè)。
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